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嗜高溫放線菌Thermobifida fusca 所分泌漆酶之生產、純化與性質探討

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200	1	\|a嗜高溫放線菌Thermobifida fusca 所分泌漆酶之生產、純化與性質探討\|f魏千媚撰
210		\|a[台中市]\|c[魏千媚]\|d民102
215	0	\|a[16],130葉\|c圖\|d30公分
300		\|a英文題名:Production, Purification and Some Properties of Extracellular Laccase from Thermobifida fusca
300		\|a指導教授:楊昭順,黃煜珺
320		\|a含參考書目
328		\|a碩士論文--靜宜大學化粧品科學學系碩士班
330		\|a本研究以蔗渣為基質，利用5公升小型醱酵槽培養嗜高溫放線菌Thermobifida fusca BCRC 19214生產胞外漆酶。經42小時培養後，培養液中胞外漆酶活性達2.3 U/mL。經陰離子交換管柱 (Q-Sepharose FF column) 和膠體過濾管柱 (SephacrylTM S-200 column) 進行純化分離後，酵素之純化倍率為4.64倍、回收率7.49%。純化的胞外漆酶經膠體過濾與SDS-PAGE分析後，估算其分子量分別為73.3 kDa 及24.7 kDa，顯示其為三倍體(trimer) 形式存在。進一步利用LC-MALDI-TOF/MS 進行蛋白質鑑定，結果發現其內部胺基酸序列與Thermobifida fusca YX 的超氧化物岐化酶 (superoxide dismutase) 胺基酸序列有高度的相似性。而經酵素活性分析，得知此一純化漆酶亦同時具有超氧化物岐化酶活性，推測為一種兼具漆酶與超氧化物岐化酶活性之多功能性氧化酶。在酵素性質方面，本實驗純化漆酶之最適溫度及pH 值分別為60℃和8.0，於50℃下加熱4小時後仍保持有95% 的漆酶活性。漆酶能有效的催化氧化藜蘆醇 (veratryl alcohol)、左旋多巴 (L-Dopa)和2,6-二甲氧基酚 (2,6-dimethoxyphenol)等基質。在pH 8.0、50℃環境下，胞外漆酶對2,6-二甲氧基酚反應之Km值為1.82 mM，Vmax為15.11 U/mL。大部分金屬離子對純化的酵素活性都沒有抑制的情形，僅1 mM Hg2+ 會些微抑制漆酶的活性。1 mM -mercaptoethanol、10 mM ethylenediaminrtetraacetic acid (EDTA) 和 0.1 mM dithiothreitol (DTT) 會明顯抑制漆酶活性。在有機溶劑方面，10~20% 之醇類對漆酶皆會明顯抑制漆酶活性，但10~20% 的乙腈 (acetonitrile) 和二甲基甲醯胺 (dimethylformamide, DMF) 並不會影響漆酶活性。漆酶與染料中間體2,6-二甲氧基酚 (2,6-dimethoxyphenol)、對胺基苯酚 (p-aminophenol)、鄰胺基苯酚 (o-aminophenol) 和對苯二胺 (p-phenylenediamine) 等染髮劑染料反應後可產生著色的效果。上述這些酵素特性，可發現新分離的漆酶在工業應用上具有潛在的用途。本研究並利用蛋白質鑑定過程中所得到之蛋白質胺基酸片段，藉由NCBI資料庫比對，再利用PCR反應，放大出胞外漆酶活性之構造基因，並選殖至pETDuet-1載體中，於大腸桿菌E.coli AD494 (DE3) 中進行表現，重組之漆酶基因長度為612個鹼基對，推演出的胺基酸長度為204。將含有胞外漆酶基因重組質體之大腸桿菌轉形株E.coli (pED-Tfu 0957) 培養在LB (含ampicillin及kanamycin) 培養基中，酵素液經Ni2+ - NTA管柱層析進行純化，純化後的酵素以蛋白質聚丙醯胺膠體電泳與西方墨點法進行分析，可分析到一個6 x His重組蛋白質之訊號，且具有漆酶活性之呈色反應，由此可辨別具漆酶蛋白質在E. coli AD494 (DE3)系統中已有成功表現。
517	1	\|aProduction, Purification and Some Properties of Extracellular Laccase from Thermobifida fusca
700	1	\|a魏\|b千媚\|4撰
702	1	\|a楊\|b昭順\|4指導教授
702	1	\|a黃\|b煜珺\|4指導教授
712	02	\|a靜宜大學\|b化粧品科學研究所\|b碩士班
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