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嗜高溫放線菌Thermobifida fusca熱安定性 β-1,3-葡聚醣酶之基因選殖、表現與性質探討

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005		20160913171612.0
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200	1	\|a嗜高溫放線菌Thermobifida fusca熱安定性 β-1,3-葡聚醣酶之基因選殖、表現與性質探討\|f徐若婕撰
210		\|a[台中市沙鹿區]\|c[徐若捷]\|d民105
215	0	\|a[13],118葉\|c圖\|d30公分
300		\|a英文題名:Cloning, Expression, and Properties of Thermostable β-1,3-Glucanase from Thermobifida fusca
300		\|a指導教授:楊昭順
320		\|a含參考書目
328		\|a碩士論文--靜宜大學化粧品科學系
330		\|a使用卡德蘭膠為單一的碳源，配置於pH 9的基礎培養基中，於50℃, 150 r.p.m.下培養Thermobifida fusca，經過60小時後，其β-1,3-葡聚醣酶活性可達到最高峰。為生產β-1,3-葡聚醣酶之最佳條件。測定活性之基質選用昆布聚醣。T. fusca所生產的胞外粗酵素液經過陰離子交換管柱層析 (DEAE-Sepharose)、膠體過濾管柱層析 (Sephacryl S-300) 純化之後，可得其純化倍率為2.43、回收率為5.98%，以SDS-PAGE進行電泳分析後，推測β-1,3-葡聚醣酶分子量約為66 kDa。T. fusca所生產的β-1,3-葡聚醣酶其最適作用的溫度以及pH值分別是60℃及pH 8，於70℃下經熱處理1小後，酵素仍有50%的活性。並且在pH 7~9皆能展現良好的活性。添加鋅、汞等金屬離子則對於酵素活性有強烈的抑制作用。抑制劑方面，加入十二烷基硫酸鈉、疊氮化鈉、β-甘硫醇、苯基甲基磺酰氟等試劑，皆會抑制至少40%之酵素活性，尤其是高濃度的苯基甲基磺酰氟 (10 mM)。另外，乙腈、丙酮以及高濃度之醇類等有機溶劑的存在都會對β-1,3-葡聚醣酶之活性造成顯著之影響。本研究選殖出β-1,3-葡聚醣酶基因，並且成功表現於E. coli AD494 (DE3) 中。比對T. fusca與NCBI資料庫當中的T. fusca YX，兩者的β-1,3-葡聚醣酶核苷酸基因序列相似度為99.96%。表現菌株E. coli (pED-13glu) 利用Ni-NTA膠體進行親和性管柱層析進行純化後，可得純化倍率為2.62倍，而回收率16.82%。而其所生產的β-1,3-葡聚醣酶其最適作用的溫度以及pH值分別是50℃以及pH 9。將β-1,3-葡聚醣酶置於40~70℃環境下四個小時，酵素保有70%之活性。而此β-1,3-葡聚醣酶在pH 6~11皆能展現良好的活性。汞離子對於酵素有強烈的抑制作用。10 mM的β-甘硫醇存在，會明顯抑制β-1,3-葡聚醣酶之活性。β-1,3-葡聚醣酶對於20%的二甲基亞碸、乙腈以及丙酮等有機溶劑有較佳的耐受性。
517	1	\|aCloning, Expression, and Properties of Thermostable β-1,3-Glucanase from Thermobifida fusca
700	1	\|a徐\|b若婕\|4撰
702	1	\|a楊\|b昭順\|4指導教授
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805		\|d008.84667\|e2844\|pBOOK
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